Ведущими направлениями деятельности Третьего отделения в николаевскую эпоху были разветвленный и всепроникающий политический сыск и общий контроль за государственным аппаратом империи. Исследователи достаточно высоко оценивают эффективность данного ведомства на первом поприще в это время:

«Третье отделение было призвано подавлять в стране дух свободолюбия, который годом ранее проявился в потерпевшем неудачу восстании декабристов. Причем тайная полиция настолько преуспела в своей борьбе со свободомыслием, что Россию миновала волна революций, потрясших крупнейшие страны Западной Европы в начале 1830-х и в 1848 г.».

Однако приспособленное к борьбе с небольшими противоправительственными организациями и крестьянскими бунтами, это ведомство оказалось не в состоянии справиться с широкомасштабным революционным движением 60–70-х гг. XIX в., начавшемся после либеральных реформ Александра II. Разгромить тщательно законспирированную организацию революционеров, избравших путь индивидуального террора, Третьему отделению оказалось не по силам. В своей деятельности оно претерпевает внутреннюю реорганизацию, выразившуюся в перераспределении функций между его структурными подразделениями.

К ведению Первой экспедиции были отнесены дела, связанные с оскорблением особы императора и членов августейшей фамилии, равно как и следствие по государственным преступлениям, т.е. важнейшие для власти процессы.

Вторая экспедиция заведует штатом Третьего отделения и продолжает собирать сведения о религиозных сектах, изобретениях, усовершенствованиях, культурно-просветительных, экономических и страховых обществах, рассматривает дела, связанные с фальшивомонетничеством, и разбирает различные жалобы и прошения о пособиях.

Третья экспедиция утрачивает свою функцию контрразведки и начинает руководить карательными мерами по борьбе с массовым крестьянским движением, общественными и революционными организациями, наблюдением за общественным мнением. В этом качестве она отдавала распоряжения о высылке неблагонадежных элементов под надзор полиции, ссылке на поселение и заключении в крепость.

Четвертая экспедиция, существовавшая до 1872 г., продолжала собирать сведения о пожарах, грабежах и убийствах, сведения о «видах на продовольствие жителей», о состоянии различных отраслей торговли, руководила борьбой с контрабандой, злоупотреблениями властей и т. п.

Пятая экспедиция была упразднена в 1865 г., подведомственное ей руководство цензурой было передано в Главное управление по делам печати Министерства внутренних дел. Вместе с тем в составе Третьего отделения была создана специальная Газетная часть, которая не только анализировала содержание периодической прессы, но и вела активную антиреволюционную пропаганду в печати.

В связи с тем что после судебной реформы 1864 г. существенно возросло количество политических процессов, в 1871 г. при главном начальнике Третьего отделения была учреждена Юрисконсультская часть, преобразованная впоследствии в Судебный отдел МВД.

Подъем революционно-демократического движения в России в царствование Александра II привел к резкому расширению масштабов слежки. Современный исследователь пишет:

«Круг лиц, за которыми Третье отделение вело наблюдение, был очень велик и не поддается даже приблизительному подсчету. Студенты и профессора, литераторы и учителя, крестьяне и рабочие, мелкие чиновники и министры, губернаторы и высшие сановники – все, кто смел думать «не по шаблону Третьего отделения», находились под его надзором и наблюдением. Даже члены императорской фамилии – великие князья и сам наследник престола – не избежали внимания со стороны этого учреждения. Родной брат императора великий князь Константин Николаевич предупреждал своего адъютанта: «Будь, пожалуйста, осторожен: мы живем в Венеции – у стен, у каждого стула и стола уши, везде предатели и доносчики!» В делопроизводстве Третьего отделения сохранилось множество агентурных донесений о том, как проводили время наследник и другие члены царской семьи. Длительное время состоял под наблюдением военный министр Д.А. Милютин, курьер которого, как выяснилось впоследствии, был «по совместительству» тайным агентом Третьего отделения. По словам государственного секретаря Е.А. Перетца, шеф жандармов постоянно докладывал государю «о частной жизни министров и других высокопоставленных лиц». Как отмечали современники, эта сторона деятельности Третьего отделения была доведена «до совершенства».