К началу XVI века началось постепенное привлечение белорусской элиты к руководству княжеством. В высшем государственном органе Великого княжества Литовского – Раде – работали белорусские магнаты и шляхтичи – Сапеги, Друцкие, Глебовичи, Вяжевичи, Зеновьевичи. В Передней Раде заседали Острожские, Ходкевичи, Глебовичи. Магнаты становились великими гетманами и великими канцлерами.

Вмешательство Польской Короны и Великого княжества Литовского в Ливонскую войну привело их и к войне с Московским царством, уничтожившим Ливонский орден. Его магистр Г. Кеттлер обратился к королю польскому и великому князю Литовскому Сигизмунду II Августу с просьбой принять Ливонию в состав союзного государства. Часть Ливонии стала литовско-польской провинцией Инфлянты, а образованное из другой части Ливонии Курляндское герцогство признало себя вассалом Великого княжества Литовского.

Военные действия переместились в белорусские земли. В 1563 году московские войска взяли Полоцк, стояли у стен Витебска, Шклова, Орши. С другой, южной стороны, земли Короны и Княжества постоянно атаковали крымские татары – они с начала XVI века около пятидесяти раз нападали на Польшу, разоряли белорусские и литовские земли. Великое княжество Литовское оказалось на грани военно-политической катастрофы. Польша напомнила ему об унии – Польское королевство предложило Великому княжеству Литовскому войти в состав Польши. Княжество предложило союз двух государств и династическую унию.

Общий сейм открылся в январе 1569 года в Люблине и продолжался почти полгода. Не договорившись, в марте послы Великого княжества Литовского покинули Люблин. В ответ поляки заняли половину литовско-белорусских земель. В Великом княжестве практически остались земли, на которых находились московские войска, строившие свои крепости – Козьяны, Туровля, Ула, Ситно, Красная. Литовские послы попытались вести переговоры с Иваном IV, но договориться не смогли. За это время все занятые Польшей у Княжества земли присягнули Польской Короне.

1 июля 1569 года Люблинская уния была подписана. Было создано полуфедеральное государство – Речь Посполитая с одним выборным королем (он же и великий князь Литовский), с общим сеймом и единой внешней политикой, однако единого правительства не было. Предусматривалась единая денежная система. Подтверждалось присоединение к Польше Подляшья, Волыни, Подолии, Киевщины. Великое княжество Литовское сохраняло свое правительство, войско, казну, законодательство, суд. Полякам запрещалось занимать государственные должности в княжестве. До конца XVII века официальным государственным языком в нем оставался белорусский.

Новый глава государства избирался на общем сейме с титулом – король Польский, Великий князь Литовский, Русский, Прусский, Мазовецкий, Жемайтский, Киевский, Волынский, Подляшский и Инфлянтский. Великий князь Литовский отдельно больше не избирался. Права поляков, литовцев и белорусов уравнивались. Сохранялся титул княжества, его печать, княжеству оставлялись некоторые суверенные права. Однако на практике все было совсем не так. Например, в сейме Речи Посполитой из 180 депутатов на литовцев приходилось 46 мест, на белорусов – 34.

Избранный королем Речи Посполитой Стефан Баторий не стал ставить Великое княжество Литовское в подчинение Короне. Это помогло ему свести на нет почти все достижения Московского царства в Ливонской войне, чему, впрочем, сильно способствовала и «деятельность» московского царя Ивана IV.

Люблинская уния была дополнена и религиозной Брестской унией 1596 года, на которой было оформлено новое направление в христианстве – униатство. После 1596 года в Беларуси действовали три религии, три церкви: римско-католическая, греко-католическая (униатская) и православная.