Н.И. Пирогов уже имел огромный опыт практической работы, если в Дерпте в госпитале было 22 койки, то в Петербурге при военно-сухопутном госпитале, где он стал работать главным врачом хирургического отделения, теперь была 1000. Здесь ему пришлось не только оперировать, но и сражаться со злом: с интригами и подлостью главного доктора госпиталя Лоссиевского. Н. И. Пирогов ужаснулся тому, что увидел: инструменты ржавые, клеенки с решетками сходство имеют, все лекарство разворовывается и продается, даже солома для тюфяков сгнила. От ран одного больного припарки и компрессы переносились бессовестными фельдшерами к другому. Даже воровство было не ночное, а дневное. После лекций в Военно-медицинской академии Н. И. Пирогов шел в госпиталь как в ад. Видя, что инструментарий не пригоден к работе, он покупал на свои деньги новый. Главный доктор госпиталя решил выжить Н. И. Пирогова из своих «владений», «сделать» профессора сумасшедшим, назначил шпионить за ним, писал ложные доносы начальству «За что возненавидел меня Лоссиевский? За правду», – говорил он своему ординатору В конце концов доведенный до отчаяния Н. И. Пирогов подал попечителю заявление об отставке. Но, к счастью, о проделках вора и подлеца Лоссиевского было известно уже до Н. И. Пирогова. Он был доставлен к попечителю…упал на колени и признался в клевете. «На другой день утром меня пригласили, – вспоминал Н. И. Пирогов, – в контору госпиталя… и там Лоссиевский… просил у меня извинения за свою необдуманность и дерзость…» Тот понял, что ему не «упечь» Н. И. Пирогова и подыскал себе теплое место. Кроме таких моральных трудностей и препон, были еще и невероятные перегрузки, работа в неприспособленных помещениях, в деревянном бараке, в котором было холодно и зимой и летом. Н. И. Пирогов работал с замороженными трупами, так как его «ледяная анатомия» была связана именно с такой методикой. Один из свидетелей его работы доктор А. Л. Эберман писал: «Этот великий муж работал нам не чета, работал без устали. Бывало, проходя поздно вечером мимо анатомического здания, старого деревянного барака, я не раз видел стоявшую у подъезда, занесенную снегом его кибитку. Н. И. работал в своем маленьком кабинете над замороженными распилами частей человеческого тела, отмечая на снятых с них рисунками топографию распилов. Боясь порчи распилов, он не щадил ни себя, ни времени и работал до глубокой ночи».

Так создавалась прикладная анатомия – физиологическая, хирургическая и патологическая. Она была еще и топографической – анатомический атлас содержал рисунки всех частей и органов человеческого тела. Он стал незаменимым руководством для врачей-хирургов при операциях больных. Непосильный труд и невероятные перегрузки привели к тому, что Н. И. Пирогов слег и смог оправиться нескоро. Через 1,5 месяца поднялся на ноги, но ничего не помнил, что с ним было, очень ослабел. Его мать и сестры, приехавшие в Петербург ухаживать за ним, рассказывали ему, что он лежал неподвижно, и лишь едва заметное дыхание говорило, что он жив.

Несмотря на предостережение врача не перегружать себя чрезмерными занятиями, скоро Н. И. Пирогов приступил к работе – кропотливому труду в анатомичке, а также к изданию «Полного курса прикладной анатомии человеческого тела». Приходилось вкладывать свои собственные средства, выбивать льготы по изданию у высокопоставленных лиц, ходить по инстанциям. Н. И. Пирогов пытается также при академии создать Анатомический институт, у одного только попечителя Веймарна он побывал на приеме 20 раз. В 1846 г., несмотря на ожесточенное сопротивление противников Н. И. Пирогова, был утвержден проект Анатомического института при Петербургской академии, а ее директором назначен Н. И. Пирогов. Это хоть немного смягчает горе безутешного ученого, потерявшего любимую жену Екатерину Дмитриевну, которая с первых минут совместной жизни поняла мужа и старалась жить только его интересами. Она умерла на следующий день после родов второго сына, так и не придя в сознание. Вечерами он уходил из дома, чтобы хоть как-то забыться, смерть жены преследовала его. Он уезжает за границу для ознакомления с заграничными анатомическими отделениями во Франции, Австрии, Италии и Швейцарии. Именно за границей он узнает об эфирном наркозе. Приехав в Петербург, сразу с головой погружается в работу – занимается его изучением.