Для интеграции в нужный сайт вводимый ген должен содержать нуклеотидную последовательность длиной не менее 50 нуклеотидов, сходную с таковой в хромосомной ДНК, в пределах которых и должен произойти физический обмен (рекомбинация) между двумя молекулами ДНК. Далее он решил выяснить, какова последовательность оснований на этом отрезке ДНК. Найти такой способ ему посчастливилось благодаря встрече с блестящим советским химиком Андреем Дарьевичем Мирзабековым. При помощи мощных химических реактивов Уолли Гилберту удалось разделить цепочки ДНК именно на нужных участках, специфичных к конкретным основаниям.

Уолли Гилберт оканчивал школу в Вашингтоне, округ Колумбия, и даже сбегал с уроков, чтобы почитать книги по физике в библиотеке Конгресса. На тот момент он боролся за приз в конкурсе по поиску молодых талантов под эгидой компании Вестингауз[8] – это был настоящий Святой Грааль для всех одаренных старшеклассников. Как и следовало ожидать, он получил эту премию в 1949 году. (Много лет спустя, в 1980 году, получив приглашение в Стокгольм, в Шведскую академию наук, Гилберт лишний раз улучшил статистику, согласно которой премия Вестингауза – одна из наиболее серьезных заявок на получение Нобелевской премии в будущем.)

Уолли Гилберт (вверху) и Фред Сенгер (внизу) – короли секвенирования

В университете и аспирантуре Гилберт занимался физикой, а в 1956 году, через год после моего прибытия в Гарвард, стал работать на физическом факультете. Когда же я увлек его опытами с РНК, которыми занимался у себя в лаборатории, Гилберт забросил свою дисциплину ради моей. Вдумчивый и непреклонный Гилберт успел немало поработать на переднем крае молекулярной биологии.

Однако из двух методов секвенирования проверку временем выдержал вариант, предложенный Сенгером. Именно этот метод секвенирования был использован в проекте «Геном человека», а затем оказался востребованным и далее, пока не уступил место красивой химической технологии, изобретенной в британском Кембридже (об этом мы поговорим в главе 8). Некоторые химические соединения, расщепляющие ДНК и необходимые при секвенировании по методу Гилберта, сложны в обращении – чего доброго, начнут расщеплять ДНК самого исследователя. В свою очередь, при работе методом Сенгера используется тот же самый фермент, который обеспечивает естественное копирование ДНК в клетках, – ДНК-полимераза. Весь фокус в том, что при копировании пары оснований немного изменяются.

Сенгер использовал не только обычные дезокси-основания (А, Т, Г и Ц), которые встречаются в естественной ДНК, но и так называемые дидезокси-основания. Основания второй категории обладают замечательным свойством: ДНК-полимераза с готовностью внедряет их в цепочку ДНК (то есть копия собирается по образцу матричной цепи). Однако, после того как в цепочку попадет дидезокси-основание, другие основания в нее добавляться больше не могут. Иными словами, скопированная нить не может достраиваться после дидезокси-основания.

Допустим, у нас имеется матричная цепь с последовательностью ГГЦЦТАГТА. В эксперименте используется множество копий такой спирали. Теперь представьте себе, что эта цепь копируется при помощи ДНК-полимеразы, но в растворе, кроме А, Т, Г и Ц, присутствует еще и дидезокси-А. Фермент работает, сначала добавляя к цепи Ц (комплементарный исходному Г), затем еще Ц, затем еще Г и еще Г. Однако, когда фермент добирается до первого Т, открываются два варианта: либо он добавит к растущей цепочке обычный А, либо дидезокси-А. Если фермент подберет дидезокси-А, то цепь далее расти не сможет и получится короткой, с дидезокси A в конце: ЦЦГГддА. Но существует также возможность того, что цепь подхватит обычное A, и в этом случае ДНК-полимераза продолжит добавлять основания: Т, Ц и так далее. Дидезокси-основание в следующий раз сможет «закоротить» цепочку не раньше, чем фермент дойдет до следующего Т. Здесь, опять же, цепочка может подхватить либо нормальное А, либо дидезокси А (ддА). При присоединении ддА цепочка тоже получится обрубленной, но чуть более длинной, чем в первый раз: у этой цепочки будет последовательность ЦЦГГАТЦддА. Подобное происходит всякий раз, когда цепь дорастает до Т и далее к ней может присоединиться А. Если случится так, что цепочка подхватит обычное А, то она продолжит расти, а если подхватит ддА – то на этом завершится.